如何利用現(xiàn)代微生物技術(shù)將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)含量豐富、營(yíng)養(yǎng)效價(jià)高的單細(xì)胞蛋白(SCP)飼料,解決資源緊缺和環(huán)境污染問(wèn)題已經(jīng)成為微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，盡管微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)SCP仍面臨很多問(wèn)題,但作為一個(gè)生物混合體系,其中的微生物之間具有生長(zhǎng)代謝協(xié)調(diào)作用,可以代替許多單菌發(fā)酵所不能進(jìn)行的生產(chǎn),因此微生物混合發(fā)酵應(yīng)用將十分廣泛。
1  單細(xì)胞蛋白
    單細(xì)胞蛋白又稱(chēng)微生物蛋白或菌體蛋白,是指酵母菌、非病源細(xì)菌、微型菌、真菌等單細(xì)胞生物體內(nèi)所含的蛋白質(zhì)。單細(xì)胞蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn):蛋白豐富,營(yíng)養(yǎng)效價(jià)高;生產(chǎn)原料來(lái)源廣泛,價(jià)格低廉;工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定;生產(chǎn)周期短,效率高。
2  單細(xì)胞蛋白制取工藝
    國(guó)內(nèi)外對(duì)SCP的制取主要集中于固態(tài)發(fā)酵工藝,即利用特定微生物對(duì)原材料纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等的降解能力,通過(guò)微生物的糖化發(fā)酵,達(dá)到產(chǎn)生大量菌體蛋白的目的。目前,在相關(guān)研究中,大多采用雙菌種混合發(fā)酵,該方法的核心是選取分解纖維素和半纖維素能力較強(qiáng)的霉菌和酵母菌同時(shí)糖化發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中,霉菌、酵母共生,霉菌通過(guò)對(duì)纖維素的糖化為酵母提供碳源,酵母通過(guò)消耗還原糖解除其對(duì)霉菌生長(zhǎng)的產(chǎn)物抑制作用。
3  微生物混合發(fā)酵
    混合發(fā)酵(MixedFermentation)一般指2種或2種以上的微生物發(fā)酵,是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展,也是一種不需要進(jìn)行復(fù)雜的DNA體外重組,卻可取得類(lèi)似效果的新型發(fā)酵技術(shù)。如最常見(jiàn)的利用纖維素進(jìn)行發(fā)酵,其底物常采用自然界中存在的纖維素類(lèi)物質(zhì),如玉米秸稈、糠類(lèi)、酒糟等廢棄物,產(chǎn)物一般為飼料蛋白、食品和一些化合物�；旌习l(fā)酵中涉及到的微生物組成種類(lèi)繁多,可以是細(xì)菌與細(xì)菌、細(xì)菌與真菌、真菌與真菌等幾種組合方式,這幾種組合方式的應(yīng)用方向大致相同,主要是利用微生物降解環(huán)境污染物,從而生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。
3.1  微生物混合發(fā)酵的特點(diǎn)
3.1.1  酶系互補(bǔ)協(xié)作  某些微生物具有對(duì)某種底物的特異降解能力,但卻缺乏對(duì)其他某些物質(zhì)的降解能力,若能根據(jù)具體情況,對(duì)已明確的微生物進(jìn)行必要的組合,使其和諧共存、協(xié)同作用,則可大大提高工作效率。李海紅等利用從牛胃中分離到的真菌發(fā)酵玉米秸稈,發(fā)現(xiàn)在單菌種發(fā)酵中,綠色木霉的降解效果明顯好于白腐菌和曲霉的降解效果,但三者結(jié)合使用的降解效果比單純使用綠色木霉的高16%,原因是白腐菌能分解秸稈中的木質(zhì)素成分,為木霉和曲霉對(duì)纖維素的降解提供了便利。
    Glancer研究發(fā)現(xiàn),選用P.stipitis和T.penicillatum混合發(fā)酵可將玉米秸稈的稀酸水解物轉(zhuǎn)化為菌體蛋白,而選用P.tannophilus和T.fermentaus亦可產(chǎn)生類(lèi)似的效果,在該體系中,P.stipitis和P.tannopHilus均可將木糖發(fā)酵成乙醇,而T.penicillatum和T.fermentaus則以乙醇為碳源。
3.1.2  降低酶的反饋抑制  在通常情況下, 混合發(fā)酵比單一純種培養(yǎng)發(fā)酵更快、更徹底。這其中的一個(gè)重要原因是在多菌發(fā)酵過(guò)程中,由于不同微生物對(duì)代謝途徑中不同物質(zhì)的及時(shí)利用有效地降低了底物的反饋抑制作用。司美茹等通過(guò)研究假絲酵母對(duì)黑曲霉和煙曲霉固態(tài)發(fā)酵中纖維素酶及淀粉酶活性的影響,結(jié)果表明:接入少量假絲酵母可大幅度提高曲霉菌纖維素酶體系中濾紙酶(FPA)、羧甲基纖維素酶(CMCase)、微晶纖維素酶(AVI)及淀粉酶的活性,這可能是酵母菌利用了水解形成的纖維二糖等小分子還原糖,從而解除了纖維二糖對(duì)纖維素酶和淀粉酶合成的阻遏,進(jìn)而提高發(fā)酵產(chǎn)物的酶活性。
3.1.3  菌種互利共生  蒲一濤等 將固氮菌(Azotobac tersp.)和纖維素分解菌(TrichodermapseudokoningiRifi)進(jìn)行混合發(fā)酵,結(jié)果表明:這2種菌的生長(zhǎng)和固氮菌的固氮作用均高于各自單獨(dú)培養(yǎng),這與固氮菌在土壤中固氮能力比純培養(yǎng)條件下高的實(shí)際情況相吻合。其原因是固氮菌除了能固定大氣中的氮素外,還能形成維生素和異生長(zhǎng)素,不僅能刺激農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育,而且能加強(qiáng)其它根際微生物的生命活動(dòng)。
3.2  微生物混合發(fā)酵注意事項(xiàng)
3.2.1 菌種組合 混合發(fā)酵菌種組合常選擇包括纖維素分解菌、木質(zhì)素分解菌、蛋白增加菌等。產(chǎn)纖維素酶菌株多選用木霉,也可用曲霉、煙曲霉、黑曲霉或宇佐美曲霉等;木質(zhì)素分解菌主要有側(cè)孢霉、白腐菌等;常用酵母菌可提高蛋白含量,如產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、啤酒酵母等。菌種搭配時(shí)應(yīng)注意菌株之間的相容性,盡量選用習(xí)性接近的微生物菌種。
3.2.2  發(fā)酵條件  發(fā)酵過(guò)程中的溫度、時(shí)間、水分、pH等因素及其交互作用對(duì)發(fā)酵影響顯著。對(duì)固態(tài)發(fā)酵而言,溫度是首要因素。因此,首先必須根據(jù)所采用的菌種組合及原料的特點(diǎn)調(diào)整好培養(yǎng)基的起始pH、含水量;其次,需根據(jù)微生物的最佳生長(zhǎng)繁殖溫度設(shè)定好培養(yǎng)溫度;最后,需明確微生物產(chǎn)生目標(biāo)代謝產(chǎn)物的最佳時(shí)間,并根據(jù)實(shí)際情況確定發(fā)酵時(shí)間。
3.2.3  發(fā)酵料處理  由于一般混合發(fā)酵采用的原料多為纖維素類(lèi)生物質(zhì)資源,因此,在發(fā)酵前有必要對(duì)原材料進(jìn)行充分的物理、化學(xué)處理,從而達(dá)到將纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等分離,使后續(xù)的酶解反應(yīng)更順利。通常采用的處理方法包括蒸煮法、酸/堿處理法、有機(jī)溶劑處理法、生物法和濕氧化法等。另外,秸稈材料中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能完全滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)繁殖的需要,因此還要添加適當(dāng)?shù)奶荚?如麩皮等)和氮源(如尿素等),以便提高產(chǎn)物的酶活力和蛋白含量。對(duì)于好氧性較強(qiáng)的微生物,添加適量的膨脹劑(如膨潤(rùn)土等)也是必要的。
4  微生物混合發(fā)酵產(chǎn)SCP研究進(jìn)展
    目前,對(duì)微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)SCP的研究主要集中在高效菌種的篩選及改良、發(fā)酵工藝的優(yōu)化改進(jìn)以及尋找合適原材料方面。
4.1  高效菌種的篩選及改良  目前, 人類(lèi)對(duì)于微生物的認(rèn)識(shí)還十分有限,一方面是受限于有限的技術(shù)條件,另一方面是由于微生物資源種類(lèi)繁多且分布廣泛�；�于微生物資源的豐富性,研究者極有可能從自然界中篩選到適合發(fā)酵和生產(chǎn)SCP的高效微生物菌株。因此,大量針對(duì)合適菌株的篩選工作也隨之展開(kāi),并且取得了良好效果。
    Banat等從科威特分離篩選出一種嗜熱芽孢桿菌Ba cillussp.(KISRITMIA,NCIMB40040),該菌在實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)過(guò)優(yōu)化的工藝處理后,能使SCP產(chǎn)率達(dá)到5.06g/(L h)。
    Gustavo等介紹了一種通過(guò)基因工程技術(shù)改良了的酵母菌   Kluyveromycesmarxianus,該菌在生產(chǎn) -半乳糖苷酶、 -葡萄糖苷酶、單細(xì)胞蛋白等活性物質(zhì)方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)在這方面也有相關(guān)的研究,涂璇等通過(guò)紫外線(xiàn)誘變選育出的纖維素酶高產(chǎn)突變株黑曲霉和煙曲霉(UA8Aspergillusfumigatus和UF2Asper gillusniger)與酵母菌混合發(fā)酵,在短時(shí)間內(nèi)可大大提高纖維素酶組分的活性,這為進(jìn)一步利用微生物發(fā)酵纖維素含量較高的秸稈類(lèi)資源、農(nóng)作物殼類(lèi)資源生產(chǎn)SCP提供依據(jù)。
4.2  發(fā)酵工藝的優(yōu)化與改進(jìn)  由于通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)篩選改良適合生產(chǎn)SCP的菌種的成本較高,不確定因素也較多,且篩選出的菌種性狀穩(wěn)定性差。因此,目前對(duì)于利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)SCP的研究更多集中于利用各種方法對(duì)其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化與改進(jìn)。Gao等通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過(guò)56h的發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)每1L培養(yǎng)基中可產(chǎn)生10.1g的marineyeastCryptococcusaureusG7a菌體細(xì)胞干重。Tipparat等在利用Schwanniomycescastellii發(fā)酵生產(chǎn)SCP時(shí),通過(guò)改變發(fā)酵工藝,大大提高了該菌對(duì)淀粉的轉(zhuǎn)化能力。
4.3  尋找合適的原料  在具備優(yōu)良菌株及良好工藝的條件下,還必須找到合適的原材料。原材料必須具備以下幾個(gè)首要條件,如價(jià)格低、取材易、數(shù)量多、糖類(lèi)物質(zhì)含量豐富等。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)原材料的研究主要集中于玉米芯、水稻秸稈、工業(yè)廢水、廢渣等。這些材料一方面造成了資源的浪費(fèi),另一方面也給環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。
    Rajoka、Matilda、廖雪義、肖佐華等的相關(guān)研究已證明米糠、多年生草、小麥酒糟、玉米秸稈、水稻秸稈等是良好的SCP生產(chǎn)原材料。隨著生物技術(shù)特別是微生物技術(shù)的發(fā)展,將有更多的材料變廢為寶。