食品和飼料中動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)
2 基于DNA 序列特異性的鑒別技術(shù)
DNA分子是大多數(shù)生命體最核心的遺傳信息儲(chǔ)存單元，在細(xì)胞中大量存在，主要分布于細(xì)胞核和線粒體、葉綠體等一些細(xì)胞器中。與蛋白質(zhì)分子相比，DNA分子除了具有種內(nèi)保守性高，種間特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)外還具有較高的熱穩(wěn)定性，而且其核苷酸序列不會(huì)受到環(huán)境和加工條件影響而改變，可獨(dú)立用于物種判別依據(jù)。因此，利用DNA分子序列特異性開發(fā)定性、定量檢測食品、飼料中動(dòng)物源性成分的方法和技術(shù)定已成為該領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)和主流，也是多數(shù)國家檢測方法標(biāo)準(zhǔn)中指定的檢測方法。
2.1 DNA 雜交技術(shù)
DNA雜交技術(shù)是PCR技術(shù)出現(xiàn)之前基于DNA序列特征識(shí)別動(dòng)物源性鑒別技術(shù)的主要類別，其原理是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原理，利用標(biāo)記有熒光素、生物素或放射性同位素等信號分子的特定DNA片段(探針)識(shí)別其互補(bǔ)序列DNA分子的技術(shù)，根據(jù)信號有無或強(qiáng)弱判斷樣品成分類別或多少。Ebbehoj和Thomsen等應(yīng)用32P-標(biāo)記探針建立了檢測生、熟牛肉中豬肉成分的DNA雜交技術(shù)，同年開發(fā)了能夠區(qū)分近親物種成分(猴和人、牛和綿羊或山羊)的條形-斑點(diǎn)雜交技術(shù)，檢出限根據(jù)檢測對象親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近分布在0.01%～10%區(qū)間。隨后出現(xiàn)了大量類似的方法，可鑒別成分涵蓋了豬、牛、羊、雞、馬等主要?jiǎng)游锓N類。用于探針設(shè)計(jì)的靶序列通常為基因組DNA、衛(wèi)星DNA等，表2列出了相關(guān)研究的統(tǒng)計(jì)信息。
由于該方法沒有經(jīng)過PCR擴(kuò)增靈敏度要低于PCR法，逐漸被PCR法替代，但近年來隨著芯片技術(shù)的發(fā)展DNA雜交結(jié)合PCR技術(shù)在高通量篩查技術(shù)中找到了新的舞臺(tái)。石豐運(yùn)等建立了能同時(shí)檢測牛、山羊、豬、雞4種動(dòng)物成分的基因芯片法，能實(shí)現(xiàn)一次反應(yīng)完成對多種動(dòng)物源性成分的種類初篩和鑒定。深圳檢驗(yàn)檢疫局開發(fā)了能同時(shí)檢測牛、羊、馬、豬、雞、鴨、鴿等16種動(dòng)物源性成分的基因芯片技術(shù)，大大提高了篩查和成分鑒定效率。
2.2 基于PCR 的動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)最早由Mullis等于1986年提出，理論上能夠?qū)悠分袉慰截惖腄NA片段進(jìn)行指數(shù)倍擴(kuò)增，將其應(yīng)用于動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)后，極大地提升了檢測靈敏度和結(jié)果可靠性。無論是普通PCR還是實(shí)時(shí)熒光PCR法，其核心內(nèi)容都是引物和探針的設(shè)計(jì)與制備，引物和探針體系的好壞決定了方法的優(yōu)劣。
線粒體DNA具有細(xì)胞內(nèi)拷貝量大、物種內(nèi)保守性高和物種間特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，常被用于擴(kuò)增靶序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，如表3～6，細(xì)胞色素b(cytochromeb)、12SrRNA、ATP酶亞基6(mitochondrialATPasesub.6)、ATP酶亞基8(mitochondrialATPasesub.8)、細(xì)胞色素c氧化酶亞基1(COX1)等都有應(yīng)用。
2.2.1 PCR- 電泳
用物種間高異性引物對樣品中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后瓊脂糖電泳分離，通過觀察是否有特異性條帶出現(xiàn)便可判定樣品中是否含有相應(yīng)的物種成分。該方法靈敏、便捷、準(zhǔn)確，而且成本低廉，大量的具體方法和技術(shù)已被建立和開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了對常見動(dòng)物源性成分(單一或混合物)的快速檢測，詳見表3。該法只適合定性檢測，也可利用凝膠成像系統(tǒng)完成半定量分析，但無法實(shí)現(xiàn)樣品中特定成分含量的精確測定。
2.2.2 PCR-RFLP
限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)是應(yīng)用物種間同源基因上特定限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)特異性來實(shí)現(xiàn)對樣品中動(dòng)物源性成分來源的識(shí)別。此方法簡單高效，無需設(shè)計(jì)物種特異性引物，使用適合的通用引物即可，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制內(nèi)切酶反應(yīng)，通過分析電泳圖譜特征來判定物種來源，但該方法適合鑒別單一成分樣品，多物種混合物樣品由于電泳圖譜較為復(fù)雜，分析難度較高，結(jié)果可靠性較低。高琳等建立了以動(dòng)物線粒體DNA中Cytb區(qū)段保守序列為靶序列的PCR-RFLP肉種檢測方法，能從豬、牛、羊、雞、鴨、兔6種生肉及高壓豬肉、豬肉火腿腸等7種熱加工肉制品中鑒別出豬源性和牛源性成分。Rea等同樣以Cytb為分析對象建立了能鑒別魚醬制品中歐洲鳀、黍鯡、沙丁魚單獨(dú)或混合DNA成分的PCR-RFLP法。Wang等進(jìn)一步擴(kuò)展了PCR-RFLP的應(yīng)用，將其和熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合建立了能夠檢測豬、牛、羊等12種肉種成分的T-RFLP技術(shù)，豐富了食品中DNA成分來源鑒定的篩查技術(shù)，該技術(shù)特點(diǎn)是將12SrRNA通用上游引物5＇端標(biāo)記上FAM染料，下游通用引物5＇端標(biāo)標(biāo)記HEX染料，配合AluI和Tru9I兩種限制性內(nèi)切酶，通過熒光和條帶長度雙重信號判定結(jié)果，提高了RFLP法的靈敏度和準(zhǔn)確性，并提供了快速鑒定食品中DNA成分來源的新途徑。表4列出了其他一些類似方法的統(tǒng)計(jì)信息。
2.2.3 PCR 測序
該方法是將特異性PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后進(jìn)行測序，并到基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對來確定待檢樣品所屬的物種類型，例如，Iijima等建立了基于18SrRNA基因測序的食品中動(dòng)植物源性成分來源分析方法，Girish等建立了基于線粒體12SrRNA基因測序的鑒定方法。我國國家標(biāo)準(zhǔn)“飼料中牛羊源性成分的定性PCR法(GB/T20190—2006《飼料中牛羊源性成分的定性檢測》)”也采用的是PCR測序方法(表6)。理論上該法準(zhǔn)確、可靠，是理想的定性檢測方法，但須經(jīng)過分離、純化和測序的步驟，過程繁瑣限制了該方法的應(yīng)用，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展其價(jià)值也在逐步顯現(xiàn)。
2.2.4 隨機(jī)引物的擴(kuò)增
隨機(jī)引物的擴(kuò)增法(randomamplifiedpolymorphicDNA-PCR，RAPD)使用非特異性引物，能與模板上多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合而不是與某一限制性位點(diǎn)特異性結(jié)合，經(jīng)過PCR擴(kuò)增反應(yīng)后可產(chǎn)生多個(gè)PCR產(chǎn)物，最有效結(jié)合的引物在擴(kuò)增過程中相互競爭而產(chǎn)生指紋，經(jīng)過凝膠電泳可產(chǎn)生物種特異性的圖譜，以此來鑒定樣品中的動(dòng)物源性成。Saez等建立了能夠鑒別豬、牛、羊、雞和火雞的隨機(jī)引物擴(kuò)增指紋圖譜技術(shù)，Cushwa等對RAPD在物種鑒定中的應(yīng)用做了詳細(xì)的綜述。RAPD的優(yōu)點(diǎn)在于無需知道分析對象的全基因組序列，但其局限性也很突出，如只適合分析單一成分樣品，而對分析多成分混合物會(huì)有一定困難。
2.2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(real-timefluorescentpolymerasechainreaction，RT-PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程的PCR技術(shù)，并可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)的出現(xiàn)使物種鑒別的靈敏性和準(zhǔn)確性都有所提高，而且該技術(shù)無需進(jìn)行電泳過程，避免了溴化乙錠等有毒染料的使用，降低了實(shí)驗(yàn)對人體的危險(xiǎn)系數(shù)。
其更大優(yōu)勢在于可通過設(shè)立外標(biāo)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對樣品中特定動(dòng)物源性成分(DNA)含量的絕對定量，通過分別加入特異性引物和通用引物實(shí)現(xiàn)特定成分的相對定量，從而實(shí)現(xiàn)對肉類食品中摻假成分含量的測定和摻假行為嚴(yán)重程度的判定。其缺點(diǎn)是檢測成本較高，包括儀器和實(shí)驗(yàn)耗材。
熒光監(jiān)測模式一般分為SYBRGreenI模式、水解探針模式、雜交探針模式3種，SYBRGreenI是一種只能與雙鏈DNA結(jié)合而無法與單鏈DNA結(jié)合的熒光燃料，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光增強(qiáng)1000倍，SYBRGreenI的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。Walker等開發(fā)了針對衛(wèi)星DNA和SINE特異性設(shè)計(jì)的能從未經(jīng)加熱處理的混合DNA樣品中定量檢出反芻動(dòng)物、牛、豬和雞源性成分的SYBRGreenⅠ熒光定量檢測方法，F(xiàn)ajardo等隨后針對12SrRNA特異性開發(fā)了類似方法，詳見表5。SYBRGreenI模式的優(yōu)點(diǎn)是無需制備探針，成本低，通用性好。但該模式對PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，造成本體較高，假陽性結(jié)果產(chǎn)生幾率較大。為了解決此問題，張慧霞等嘗試用將溶解曲線分析引入到SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)中，成功實(shí)現(xiàn)了混合物樣品中鵪鶉成分的檢出，在特異性和成本上找到了較好的平衡。
TaqMan探針法是水解探針模式的一種，引入了5＇端和3＇端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，通過Taq酶5＇端外切酶活性釋放熒光信號，只有當(dāng)樣品中含有擴(kuò)增目的基因，并啟動(dòng)擴(kuò)增過程后熒光信號才會(huì)出現(xiàn)并逐漸積累，其信號強(qiáng)度與擴(kuò)增出目的DNA片段有著緊密的正相關(guān)關(guān)系。與靶基因模板序列互補(bǔ)探針加強(qiáng)了信號特異性，使得TaqMan探針法在特異性上具有無以比擬的優(yōu)勢，是目前使用較多的方法類型。Rodríguez等建立起了混合肉樣中豬肉成定量檢測的TaqMan方法。
該方法基于線粒體12SrRNA基因序列設(shè)計(jì)了豬特異性引物和哺乳動(dòng)物通用引物，兩套引物、探針位于相近位置，極大降低了由于擴(kuò)增效率和加工過程中基因斷裂產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，但其擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為425～428bp，不利于檢測熱加工后的樣品。Zhang等采用類似的設(shè)計(jì)理念，基于線粒體中細(xì)胞色素b，建立了能夠定量檢出鮮肉、熟肉制品、乳和乳酪中牛源性DNA的TaqMan方法，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度僅為133bp，能檢出35pg級的牛源性DNA，且無交叉反應(yīng)。
TaqMan探針法的缺點(diǎn)在檢測成本高和由于熒光淬滅不徹底導(dǎo)致的本底偏高，而新型的TaqMan探針——“MGB探針”有效解決了這一問題，使本底信號大大降低，Tanabe等據(jù)此建立了能夠檢出10ng/μL小麥線粒體DNA中100fg/μL的豬、雞、羊、馬肉DNA成分的方法，線性擬合度在0.994～0.999之間。
Abdulmawjood等將反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與MGB探針技術(shù)結(jié)合，建立了樣品中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)這一中樞神經(jīng)特異性標(biāo)志物的mRNA的RT-PCR檢測法，實(shí)現(xiàn)了對樣品牛中樞神經(jīng)系統(tǒng)成分(CNS)的定向檢測，該方法具有很好的特異性，與心、肝、肺等非中樞神經(jīng)組織均無交叉反應(yīng)，檢出限為0.01%而且不會(huì)受到加熱工藝的影響。
雜交探針模式包括FRET雙雜交探針法、分子信標(biāo)法等和屬于第3代熒光探針技術(shù)的Amplifluor法、LUX法等，也是適應(yīng)熒光PCR常見的技術(shù)類型，但在食品和飼料中動(dòng)物源性DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域中還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。
實(shí)時(shí)熒光法的另一優(yōu)勢在于可通過標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)(FAM、TET、VIC、HEX等)，實(shí)現(xiàn)多重PCR反應(yīng)多通道同步實(shí)時(shí)檢測，大大提高了檢測通量和效率。
雖然該技術(shù)試劑成本較高，不適于現(xiàn)場快速檢測，但由于其在靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性等重要性能參數(shù)上無可比擬的優(yōu)勢，仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和趨勢，是作為仲裁方法和司法鑒定的理想技術(shù)類型，是現(xiàn)行國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中指定的方法之一。
2.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種嶄新的DNA擴(kuò)增方法，與普通PCR相比其最大的特點(diǎn)是利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶(如BacillusstearothermophilusDNApolymerase)在65℃對樣品中DNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，而無需進(jìn)行溫度變化循環(huán)，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。Ahmed等開發(fā)出了基于環(huán)介導(dǎo)基因恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和電化學(xué)芯片技術(shù)聯(lián)用的動(dòng)物源性成分生物傳感鑒定技術(shù)(圖1)
，分別能檢出混合樣品中20.33ng/μL的豬肉成分，20.33ng/μL的雞肉成分，以及78.68pg/μL的牛肉成分。該技術(shù)為肉種鑒別技術(shù)小型化、便攜化合自動(dòng)化開辟了新的途徑。LAMP法也有局限性，由于是鏈置換合成，不適合進(jìn)行長鏈DNA的擴(kuò)增，在產(chǎn)物回收鑒定、克隆、單鏈分離方面的表現(xiàn)也不如傳統(tǒng)PCR。準(zhǔn)，由于動(dòng)物DNA組的復(fù)雜性，單純PCR產(chǎn)物分析較容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此為了提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)中指定的方法通常在特異性PCR擴(kuò)增結(jié)果后加上限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證或測序的步驟。由于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR法中引入了特異性的探針分子大大增強(qiáng)了信號的特異性和結(jié)果準(zhǔn)準(zhǔn)確性。上述兩種方法是我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的指定鑒定方法，詳見表6。
但目前所指定的方法都是定性檢測方法，還未涉及定量檢測方法，定量檢測方法還待進(jìn)一步研究和建立。
