霉菌毒素常常發(fā)生在飼料和食品中，是由真菌產(chǎn)生的有毒、小分子次生代謝產(chǎn)物，包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧血腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、伏馬毒素等，對(duì)人類和動(dòng)物存在潛在的危害。
1 常用方法
　　 霉菌毒素的檢測(cè)方法很多，但由于霉菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性復(fù)雜，在樣品中分配不均和基質(zhì)的干擾，使其分析更加復(fù)雜。飼料的樣品基質(zhì)對(duì)霉菌毒素的影響最大，因?yàn)轱暳鲜怯啥喾N物質(zhì)混合在一起的，不同的物質(zhì)中的霉菌毒素檢測(cè)的程序是不同的。通常，首先要對(duì)懷疑被污染的物質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的樣品處理，從樣品中提取毒素，分析之前再進(jìn)行洗脫除去雜質(zhì)的干擾。在實(shí)際的分析中，有些方法可直接進(jìn)行分離和定量，有些方法在分離和定量之前需要對(duì)霉菌毒素進(jìn)行衍生。
　　有些霉菌毒素具有一個(gè)熒光特性的發(fā)色基團(tuán)，如黃曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素(OT)、玉米赤霉烯酮(ZE)，樣品的提取物經(jīng)常用薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)來(lái)分離結(jié)構(gòu)相似的化合物和污染物。
　　通過(guò)比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品色譜的比移值(Rf)和保留時(shí)間來(lái)定性霉菌毒素，通過(guò)熒光強(qiáng)度和吸光度來(lái)定量霉菌毒素。一些霉菌毒素含有單端孢霉烯團(tuán)，最大吸收值還不清楚，通常用氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜進(jìn)行檢測(cè)。這些樣品在提取后，上樣之前通常需要進(jìn)行柱前衍生。TLC和HPLC的方法對(duì)單端孢霉烯團(tuán)有效，但對(duì)黃曲霉毒素的敏感性和特異性不強(qiáng)。TLC對(duì)谷物中的脫氧血腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)限是50～100μg/kg。
2 霉菌毒素分析的發(fā)展趨勢(shì)
2.1 提高采樣和質(zhì)量控制
　　霉菌毒素的分析步驟較多，每一步都有可能造成誤差，霉菌毒素分析的變異系數(shù)(CV)大于30%是很普遍的。因此，霉菌毒素分析技術(shù)的提高應(yīng)主要從以下幾方面入手：①簡(jiǎn)化分析程序、盡可能縮短分析步驟；②減少基質(zhì)干擾，提高定量步驟的敏感性和特異性；③優(yōu)化樣品制樣，減少制樣誤差。美國(guó)規(guī)定了被黃曲霉毒污染的花生的制樣粒徑，歐洲幾國(guó)也作了規(guī)定，要求樣品制樣必須少量多樣。
　　美國(guó)的花生工業(yè)制定了一個(gè)連續(xù)的計(jì)劃，即通過(guò)降低不一致獲得相同的目標(biāo)化合物。隨著更簡(jiǎn)單、更精確、更昂貴的篩查和定量方法的發(fā)展，使用多樣品而不是一個(gè)量大的樣品來(lái)分析更加實(shí)際。樣品的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，尤其是在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室分析之前，應(yīng)避免在樣品收集過(guò)后產(chǎn)生霉菌毒素，造成制樣誤差。
　　提高質(zhì)量控制的另一個(gè)重要方面是使用質(zhì)控物質(zhì)。VanEgmond等人研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)花生中的黃曲霉毒素時(shí)，分析產(chǎn)生的主要誤差來(lái)源于前處理時(shí)不完全提取和霉菌毒素的損失，當(dāng)加入質(zhì)控物質(zhì)同時(shí)分析樣品時(shí)，分析方法準(zhǔn)確度得到提高。Sharman等人在一個(gè)新方法評(píng)估中了使用質(zhì)控物質(zhì)，同時(shí)使用了免疫親和色譜和柱-高效液相色譜方法分析花生奶中的黃曲霉毒素，方法的準(zhǔn)確度和精確度都得到了提高。
2.2 使用極性溶劑提取霉菌毒素和使用柱分離樣品
　　使用有機(jī)溶劑提取霉菌毒素的花費(fèi)高，而且大家越來(lái)越認(rèn)識(shí)到有機(jī)溶劑的毒性，開始使用毒性小、價(jià)格低的極性溶劑，如水和甲醇、水和乙腈。另外，可使用高容量，更加有效的填充小柱代替硅膠和硅酸鎂載體大柱，免疫親和色譜柱也可作為霉菌毒素的前處理工具。這些新方法不僅節(jié)約了有機(jī)溶劑和分析時(shí)間，而且更加有效。盡管新的樣品的提取方法有所發(fā)展，但對(duì)于一些新的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，如免疫測(cè)定方法和質(zhì)譜測(cè)定方法，這一步驟可完全省略。對(duì)一些液體樣品，如尿、牛奶等，提取、洗脫和濃縮可一步完成。
2.3 色譜技術(shù)的提高
　　雖然薄層色譜法沒有什么明顯的進(jìn)步，但這一方法在霉菌毒素分析中被普通采用。預(yù)涂布(色譜)板是為高效薄層色譜法和反向薄層色譜法板商品化制造的，使用HPTLC板比傳統(tǒng)的薄層色譜板好，這是由于分析時(shí)可使用較少的溶劑。Bardburn等對(duì)谷物中黃曲霉毒素的幾個(gè)檢測(cè)方法進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)采用雙向HPTLC聯(lián)合苯基相方法凈化AF，回收率和精確度都提高。Bell等用HPLC、HPTLC、ELISA檢測(cè)花生醬中的AF，發(fā)現(xiàn)HPTLC比ELISA方法得到的數(shù)據(jù)更穩(wěn)定和變異系數(shù)更低。
　　HPLC方法在霉菌毒素(含有熒光和發(fā)色基團(tuán))檢測(cè)中的應(yīng)用始于19世紀(jì)70年代中期，使用化學(xué)吸收物質(zhì)有效地填充柱子，檢測(cè)器的效率、靈敏度和重現(xiàn)性均得到了較大提高�？梢姡琀PLC檢測(cè)霉菌毒素是一種非常有效的方法。
　　使用極性溶劑作為萃取溶劑和簡(jiǎn)化洗脫程序成了一種趨勢(shì)，在分析霉菌毒素如AF、OT、橘霉素、棒曲霉素、霉菌毒素的單端孢霉烯(TCTC)等時(shí)，使用反向的色譜柱也是一種趨勢(shì)。如AFB和AFG在經(jīng)過(guò)半縮醛衍生轉(zhuǎn)化后，熒光強(qiáng)度加強(qiáng)，AFB2a和AFG2a這兩個(gè)衍生物比AFB和AFG極性更高，更適合用反向色譜柱分離。因此HPLC是分析AF及其衍生物最常用、最有利的方法，即用反向C18柱進(jìn)行分離，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量。因而，這個(gè)程序包括分離、定量和確證。1990年，HPLC檢測(cè)谷物和花生制品中的AF被美國(guó)官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會(huì)首次采用。
　　其他檢測(cè)方法，如常規(guī)相柱層析硅膠分離后AF用碘/溴柱后衍生，或者反相柱采用柱前衍生的方法，熒光強(qiáng)度也得到有效提高。OT和ZE用碘溶液柱前衍生沒有提高熒光強(qiáng)度。然而氨溶液作為柱前衍生試劑能加強(qiáng)OT的熒光強(qiáng)度。Francis等研究發(fā)現(xiàn)，在分析谷物中的AF時(shí)，β-環(huán)式糊精能加強(qiáng)其熒光強(qiáng)度。
　　除了AF和OT采用HPLC柱后或柱前衍生外，其他霉菌毒素如柄曲霉素、含有TCTC和煙色基團(tuán)的霉菌毒素，沒有發(fā)色和熒光基團(tuán)的，也采用該方法檢測(cè)。如煙曲霉毒素含有1個(gè)氨基基團(tuán)和幾個(gè)羧酸基團(tuán)，鄰苯二甲醛熒光試劑常用作衍生化試劑來(lái)增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度。
　　隨著可見光-紫外多波長(zhǎng)的發(fā)展，如光電二極管整列檢測(cè)器和多通道二極管整列檢測(cè)器，聯(lián)合計(jì)算機(jī)的搜索能力，可以實(shí)現(xiàn)色譜柱分離后對(duì)整個(gè)化合物的光譜圖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果得到了更進(jìn)一步的確定。激光熒光法和同步熒光法在HPLC方法中也被使用起來(lái)提高檢測(cè)器的靈敏度。
　　大量的分析樣品需要檢測(cè)，就需自動(dòng)化AF檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)步驟，在線分析、濃縮的自動(dòng)化，免疫親和色譜柱作為凈化步驟，HPLC定量分析，使得HPLC分析霉菌毒素進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代。
　　氣相色譜(GC)、毛細(xì)管超臨界流體色譜-負(fù)離子化學(xué)電離質(zhì)譜法也用來(lái)檢測(cè)霉菌毒素，對(duì)含有單端孢霉烯(TCTC)基團(tuán)的霉菌毒素GC檢測(cè)方法仍然是最有效的。
2.4 質(zhì)譜方法的新發(fā)展
    在早期的調(diào)查中，質(zhì)譜沒有考慮作為霉菌毒素的定量方法。隨著質(zhì)譜的分辨率和計(jì)算機(jī)搜索能力的的提高，質(zhì)譜在霉菌毒素的定量和確定上得到了新發(fā)展。
2.4.1 高分辨率的質(zhì)譜
    高分辨質(zhì)譜化學(xué)電離方法常常產(chǎn)生1個(gè)正離子或1個(gè)負(fù)離子，強(qiáng)調(diào)產(chǎn)生1個(gè)分子離子作為黃曲霉毒素的分析。
    場(chǎng)解吸質(zhì)譜和快速原子轟擊和電力方法一起被應(yīng)用。
2.4.2 氣相色譜質(zhì)譜法
    隨著GC-MS的應(yīng)用，每個(gè)化合物可選用3個(gè)離子進(jìn)行質(zhì)譜掃描。而且這種方法能檢測(cè)μg/mg級(jí)甚至更小的霉菌毒素，但還是存在相同的保留時(shí)間其他物質(zhì)的干擾。
2.4.3 串聯(lián)質(zhì)譜
    該方法目前已被廣泛使用。第一步是質(zhì)子分離，從基質(zhì)中選擇目標(biāo)化合物，如分子離子、質(zhì)子化分子、分子負(fù)離子。第二步是用目標(biāo)氣體如氬氣碰撞活化解離，母離子和子離子被用來(lái)分析。與選擇性模式相比，串聯(lián)質(zhì)譜的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)叫多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
    Uyakual等使用GC串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)AF進(jìn)行了檢測(cè)。
2.4.4 液相色譜質(zhì)譜法
    隨著儀器的發(fā)展，可將質(zhì)譜和液相色譜聯(lián)合起來(lái)測(cè)定霉菌毒素，如高速原子沖擊法、熱噴霧、等離子體噴霧、動(dòng)態(tài)的原子轟擊質(zhì)譜測(cè)定法，聯(lián)合LC已經(jīng)運(yùn)用在多種霉菌毒素的分析上。
2.5 生物分析的提高
    霉菌毒素生物分析的進(jìn)展也得到了提高，用來(lái)檢測(cè)鰓足蟲、老鼠纖維原細(xì)胞培養(yǎng)、幼鼠腎細(xì)胞中的含TCTC基團(tuán)的霉菌毒素等。液式細(xì)胞計(jì)檢查在測(cè)定20份不同的霉菌毒素和毒性真菌提取物中小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS-1的生存能力時(shí)是有效的。然而，大多數(shù)生物分析既不靈敏也不特效，僅僅用來(lái)作為掃描一般毒素的一種手段。
3 免疫化學(xué)發(fā)展的加強(qiáng)
    為了克服在化學(xué)和生物分析中遇到的困難，免疫化學(xué)方法得到了發(fā)展。因?yàn)槊咕�毒素不是一種抗原，研究重點(diǎn)放在它們需要與蛋白質(zhì)和多肽鍵合在一起，在兔子和其他動(dòng)物里產(chǎn)生多克隆抗體。隨著雜種瘤細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)多種霉菌毒素的單克隆抗體也制備出來(lái)。隨后，多種免疫分析方法，如放射性免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)和其他幾種比較先進(jìn)的免疫化學(xué)掃描方法也用于檢測(cè)霉菌毒素。這些方法都很靈敏、特效、操作簡(jiǎn)單。特效抗體已經(jīng)被制備成免疫組織化學(xué)染色試劑并作為提取工具的免疫親和柱�？梢�，免疫分析在霉菌毒素分析中得到了廣泛運(yùn)用。
    在討論不同類型的免疫分析過(guò)程之前，必須考慮以下幾個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)：①因?yàn)榇蠖鄶?shù)霉菌毒素的免疫分析存在著有毒樣品和無(wú)毒樣品鍵合競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題。因此，對(duì)于抗體分子的特殊鍵合位點(diǎn)，除了在分析中有特殊的抗體外，還要有一個(gè)好的霉菌毒素標(biāo)記；②對(duì)于精確定量，分離毒素的自由基和鍵合形式是很重要的；③抗體交叉反應(yīng)(特異性)和結(jié)構(gòu)類型變化較大，在分析中應(yīng)熟悉抗體的特異性；④樣品中結(jié)構(gòu)相似的化合物的存在，與抗體發(fā)生反應(yīng)是可能的。
    因此，在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)該檢查基質(zhì)。以下描述的大多數(shù)免疫分析，樣品沒有凈化。樣品從固相基質(zhì)中提取后，用合適的緩沖溶液稀釋后，直接進(jìn)行分析。然而，在適當(dāng)?shù)牡南疵摵�，靈敏度有所提高。
3.1 放射免疫
    放射免疫程序是將特殊抗體、未知樣品溶液或已知標(biāo)準(zhǔn)品和一系列的標(biāo)記毒物一起培育，在自由基和鍵合毒物分離后，測(cè)定片段中的放射強(qiáng)度，樣品中霉菌毒素的濃度通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)品比較而被確定。放射性標(biāo)記物的特殊活性對(duì)實(shí)驗(yàn)方法靈敏度非常重要。放射免疫方法能夠檢測(cè)到樣品的ng級(jí)甚至更低。放射性免疫法在提取或使用高活性的標(biāo)記物后通過(guò)凈化能夠提高靈敏度。雖然放射性免疫檢測(cè)法檢測(cè)霉菌毒素能得到精確的數(shù)據(jù)，但因涉及放射性物質(zhì)的使用，主要用于研究性實(shí)驗(yàn)。
3.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法
    有2種酶聯(lián)免疫測(cè)定法可用來(lái)檢測(cè)霉菌毒素即使用霉菌毒素—酶鍵合物的直接ELISA和使用霉菌毒素—蛋白質(zhì)鍵合物和鍵合了酶的鍵合物的間接ELISA，辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶常作為鍵合酶使用。
3.3 快速掃描檢測(cè)方法
    在間接和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法中，通過(guò)縮短培養(yǎng)時(shí)間，調(diào)整酶和抗體的濃度，在一定濃度水平快速測(cè)定樣品，其原理和ELISA的原理相同。該方法反應(yīng)時(shí)間大大縮短，約需10～15min。
    Dewey等利用單克隆抗體建立了快速掃描方法檢測(cè)稻粒中的島青霉。另一種掃描方法是免疫親和方法，應(yīng)用于有熒光的霉菌毒素，如AF和OT的檢測(cè)。其過(guò)程是先用免疫親和柱洗脫，再用熒光檢測(cè)器檢測(cè)其濃度。
4 化學(xué)分析和免疫化學(xué)檢測(cè)方法互補(bǔ)
4.1免疫親和色譜為化學(xué)分析提供凈化工具
    1977年Sun等首次將免疫親和柱應(yīng)用于RIA檢測(cè)方法，后來(lái)用于測(cè)定尿和牛奶樣品中的AFM。該方法早期主要用于生物液體中，后來(lái)大量用于AF的檢測(cè)，包括固體樣品。大量研究表明該方法對(duì)AF的凈化非常有效。免疫親和柱和柱后衍生化試劑聯(lián)合應(yīng)用檢測(cè)日用品中的AF已經(jīng)成為官方方法。Carmen等采用自動(dòng)控制的免疫親和柱凈化牛奶中AF并測(cè)定其含量。
4.2 免疫親和色譜
    ELISA作為HPLC的柱后監(jiān)測(cè)系統(tǒng)用于分析含TCTC基團(tuán)的霉菌毒素。該類毒素首先被反向C18柱分離，分離出的霉菌毒素進(jìn)行ELISA分析。這種方法不僅能確定含TCTC基團(tuán)的霉菌毒素，而且能夠進(jìn)行定量。低濃度的T-2毒素、相關(guān)的單端孢菌素及其代謝物也能通過(guò)這種方法檢測(cè)。已證明HPLC和ELISA聯(lián)合分析TCTC霉菌毒素是有效、靈敏、特異的。同樣，ELISA和TLC聯(lián)合也可用于分析霉菌毒素，即先通過(guò)TLC初步提取，然后用ELISA分析。