2 天蠶素抗菌肽CAD
2.1 天蠶素抗菌肽
天蠶素抗菌肽(Cecropins) 屬于陽離子抗菌肽家族中重要的一族，最早由瑞典科學家B o m a n  等于1980 年用陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導惜古比天蠶(Hy a l o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹后發(fā)現(xiàn)。天蠶素抗菌肽是世界上發(fā)現(xiàn)最早，也是研究最徹底、效果最明顯的一類抗菌肽，是昆蟲非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，一般由31 ～ 39 個氨基酸組成，分子量約為3.5k D a ～ 4k D a 左右，其分子結(jié)構(gòu)相對保守，主要由α 螺旋構(gòu)成，屬于α 螺旋類抗菌肽。這類抗菌肽熱穩(wěn)定性好，無免疫原性，抗菌能力強，能有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長。研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽對一些真核細胞不具毒性作用，如家蠶cecropin A 和cecropin B 能夠抑制并殺死白色念珠菌，但對人體細胞株J u r k a t 沒有毒性，即使在高濃度下，也不會使真核生物的紅血球發(fā)生溶解破裂。這些結(jié)構(gòu)和功能上的特性使天蠶素類抗菌肽成為抗菌肽應用和研究的重要對象。
2.1.1 天蠶素抗菌肽的構(gòu)效關系 由于Cecropin 分子結(jié)構(gòu)相對保守，一般為α 螺旋- 鉸鏈-α 螺旋結(jié)構(gòu)，N 末端雙親α 螺旋；C 末端疏水α 螺旋，這種N 末端雙親α螺旋結(jié)構(gòu)對于天蠶素抗菌肽發(fā)揮作用非常重要。F u 和Srisailam 等研究表明，α 螺旋對抗菌肽的殺菌活性強弱起著重要作用，同時其殺菌能力的強弱還與殺菌過程中Cecropin 在脂質(zhì)表面聚攏的濃度和分子方向有關。
2.1.2 天蠶素抗菌肽的作用機制 目前，對于Cecropins的抗菌機制尚無定論，但普遍認為是通過破壞質(zhì)膜脂質(zhì)機制造成，即其通過自身陽離子所攜帶的正電荷與帶負電荷的細菌脂膜之間的電荷作用，插入其中擾亂磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，使細胞脂膜去極化并在表面形成孔洞，造成細菌細胞因內(nèi)容物外泄而死亡。這一過程分為兩個階段：Cecropins 與脂膜之間的相互作用和Cecropins 對脂膜的破壞。Hiromi 等研究發(fā)現(xiàn)，不同的天蠶素類抗菌肽可能具有不同的破壞質(zhì)膜機制。2.1.3 天蠶素抗菌肽雜合肽 為了尋找更高效低毒的抗菌肽，使通過改造后的天然抗菌肽分子更小、活性更高，同時減少對真核生物的毒性及降低生產(chǎn)成本，研究者通過互聯(lián)網(wǎng)和計算機軟件比較分析了大量有關抗菌肽的序列和空間結(jié)構(gòu)，根據(jù)分析結(jié)果設計具有更好抗菌活性的抗菌肽分子，使這些重組基因抗菌肽與人工設計的抗菌肽具有活性更高、抗菌譜更廣、熱穩(wěn)定性好、沒有抗原性、沒有溶血作用等特點。如Fink 等研究發(fā)現(xiàn)，將CecropinA 和Cecropin D 的序列片段用固相法化學合成的雜合肽CAD，其抗菌活性高于天然的Cecropins 類抗菌肽，且抗菌譜也有所增加。Wachinger 等研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素和蜂毒素的雜合肽可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HI V -1的基因表達，從而減少HI V -1 的增殖。但由于人工固相合成價格昂貴，不能進入實用領域，因此，雜合肽作為一類潛在的新型抗菌肽需要進一步研究。目前，國內(nèi)外學者已經(jīng)在雜合肽的基因工程方面做了很多研究工作，為雜合肽的開發(fā)和應用奠定了良好的基礎。
2.2 天蠶素抗菌肽CAD
2.2.1 天蠶素抗菌肽CAD 簡介 天蠶素抗菌肽CAD(Cecropin A and D，CAD) 是對Cecropins 類抗菌肽改造過程中，通過氨基酸替換的方法，設計合成的由含正電荷較高的Cecropin A(1-11) 片段和疏水性較強的Cecropin D(12-37) 片段構(gòu)成的雜合肽。CAD 由37 個氨基酸組成，分子量為3.8k D a，其二級結(jié)構(gòu)中78.38% 為α 螺旋，其余為無規(guī)則卷曲。其中Cecropin A(1-11) 片段被認為能形成典型的α 螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明CAD對被測試的6 種細菌的抗菌活性分別為天蠶素D 抗菌活性的5 ～ 55 倍，與天蠶素A 相比，其抗菌活性也略高。在抗枯草芽孢桿菌上，CAD 的活性比天蠶素A 高6 倍左右，增加的活性源于C A D 在序列中部和羧基端同天蠶素D 具有相類似的結(jié)構(gòu)，即比天蠶素A、B 更強的螺旋程度和羧基末端更強的疏水性。C A D 顯著的特征是能夠快速在人工膜上形成電壓依賴型離子通道的能力。目前該雜合肽C A D 已由國家飼料工程技術研究中心通過基因工程方法在枯草桿菌表達載體中表達獲得，表達產(chǎn)物活性高、理化特性好，且抗菌特性比目前國內(nèi)外文獻報導的具有優(yōu)勢。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)順利解決了抗菌肽產(chǎn)品生產(chǎn)成本昂貴這一限制其廣泛應用的瓶頸，在獸藥和飼料添加劑領域具有廣闊的應用前景。
2.2.2 由枯草芽孢桿菌作為C A D 表達系統(tǒng)的優(yōu)勢 用大腸桿菌作為表達載體會形成以不可溶狀態(tài)內(nèi)含體形式存在的緊湊型多肽分子，這種內(nèi)含體蛋白是喪失生物學活性的，如果要恢復其部分活性需要經(jīng)過復雜的溶解、再折疊和純化過程。用酵母表達系統(tǒng)如畢赤酵母表達系統(tǒng)可以解決這些翻譯后加工問題，但是隨后的分批培養(yǎng)過程卻需要耗費大量的成本，這使酵母表達系統(tǒng)作為抗菌肽的表達系統(tǒng)也不現(xiàn)實�？莶菅挎邨U菌表達系統(tǒng)不會存在上述兩種表達系統(tǒng)作為表達載體時出現(xiàn)的問題，特別是對異種蛋白的分泌上。由枯草芽孢桿菌表達的外源蛋白通常以具有生物活性的形式存在，且其下游的純化過程被極大簡化。該表達系統(tǒng)還有個優(yōu)點，在這種理論上較高表達量的情況下，表達產(chǎn)物不會在表達系統(tǒng)內(nèi)累積，為繼續(xù)培養(yǎng)和生產(chǎn)提供了可能，進而極大的簡化了目的蛋白的表達過程和降低生產(chǎn)成本。
2.2.3 天蠶素抗菌肽CAD 穩(wěn)定性 伍小松 等對天蠶素抗菌肽C A D 熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，天蠶素類抗菌肽C A D 在37℃～ 55℃時具有較高活性，而人和畜禽的體溫接近40℃，這滿足其發(fā)揮活性的溫度條件。此外，該產(chǎn)品耐熱性和耐酸性效果較佳，在100℃水浴15mi n 后或pH為1 時仍表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的抗性。在被胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后，CAD 仍然具有活性。
2.2.4 天蠶素抗菌肽C A D 安全性 譙仕彥等( 資料未發(fā)表) 研究了天蠶素抗菌肽CAD 的安全性，結(jié)果表明：對大、小鼠經(jīng)口急性毒性試驗的LD50 ＞ 5000mg/kg 體重；小鼠精子畸形和骨髓細胞微核試驗結(jié)果均為陰性；對大鼠無亞慢性毒性；無明顯生殖毒性和胚胎毒性；無慢性毒性和致癌性。3 天蠶素抗菌肽CAD 在畜牧生產(chǎn)中的應用
3.1 對大鼠生長性能和免疫功能的影響
    陳香 等研究表明在大鼠日糧中添加75mg/kg 的天蠶素抗菌肽，可提高大鼠平均日增重和日采食量，并可降低料肉比。在試驗第14d 時，抗菌肽促進小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)是機體脾臟和胸腺發(fā)育程度的一個重要反映，說明天蠶素抗菌肽具有增強機體免疫功能。王阿榮 等也發(fā)現(xiàn)，日糧中添加天蠶素抗菌肽能提高斷奶仔豬的機體免疫性能。
3.2 對豬生長性能的影響
    陳香 等研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中用250m g /kg 的天蠶素抗菌肽CAD 替代10% 的硫酸抗敵素300mg/k g 和10% 的桿菌肽鋅1500m g / k g 的抗生素組合，斷奶仔豬日增重提高5.4% ～ 9.7%，飼料轉(zhuǎn)化效率改善14% ～ 18%，腹瀉率降低30% 以上。說明斷奶仔豬日糧中使用天蠶素能起到顯著促生長和保健作用。王阿榮 等在仔豬日糧中添加天蠶素抗菌肽研究發(fā)現(xiàn)，天蠶素抗菌肽能提高北京原種黑豬斷奶仔豬的生產(chǎn)性能和機體免疫性能。雷東風 等研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加天蠶素抗菌肽能增加斷奶仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。李波 等在母豬產(chǎn)前30d 和產(chǎn)后21d 飼糧中添加400m g / k g 的天蠶素發(fā)現(xiàn)母豬的繁殖性能和仔豬的生長性能等指標均高于以抗生素作為添加劑的對照組。試驗結(jié)果顯示，添加天蠶素組活仔率提高5.6%，死胎率減少74%，仔豬腹瀉率下降47%。
3.3 對肉雞生長性能的影響
    單達聰 等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加天蠶素抗菌肽能提高艾維茵肉雞增重率(1.67% , P <0.05) 和采食量(5.46% )，降低料肉比(1.77% )。李波 等研究發(fā)現(xiàn)在肉雞日糧中添加天蠶素抗菌肽可提高肉雞的生產(chǎn)性能和抗病能力。在存活率方面，飼料中添加天蠶素抗菌肽組比對照組提高了0.26%。在料肉比方面，試驗組比對照組降低了2.46%。即添加天蠶素抗菌肽的試驗組上述指標明顯高于抗生素作為添加劑的對照組。
3.4 對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生長性能的影響
    王冬冬 等研究發(fā)現(xiàn)，添加100m g / k g 天蠶素抗菌肽對鯉魚末重和特定生長率具有顯著的提高作用(P＜ 0.05)。黃滄海 等研究顯示，在羅非魚日糧中添加100m g / k g 的天蠶素抗菌肽，特定生長率可提高約3%，其它指標與添加250mg/kg 的8% 黃霉素無顯著性差異。
4 展望
    抗菌肽具有新的抗生素類所需要的很多特性。它可以作為單獨的抗菌劑使用，也可以與傳統(tǒng)的抗生素聯(lián)合使用發(fā)揮協(xié)同作用，作為免疫調(diào)制劑或中和內(nèi)毒素，因此抗菌肽的臨床應用潛力很大。盡管抗菌肽在殺滅一些敏感病菌時效果不如特定的傳統(tǒng)抗生素好，但其優(yōu)勢之一就是能有效地作用于多重耐藥性菌，其殺菌作用十分迅速且具有復雜的細菌胞內(nèi)作用靶點，而不易形成耐藥性。經(jīng)過人工改造的天蠶素抗菌肽C A D 較原有天然天蠶素抗菌肽具有穩(wěn)定性更好、抗菌譜更廣、活性更高的優(yōu)點。且作為飼料添加劑而言，以工程菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境的影響。同時抗菌肽產(chǎn)品具有廣譜抗菌作用，對畜禽具促生長、保健和治療疾病的功能，屬無毒副作用、無殘留、無致細菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑，對畜牧生產(chǎn)，飼料加工的發(fā)展都有巨大的推動作用。要進一步推動抗菌肽的應用，還必須深入研究以下問題：①抗菌肽在生命體特別是高等生命體防御系統(tǒng)中的準確定位以及生物模式；②抗菌肽表達水平與各種疾病的相關性；③抗菌肽構(gòu)效關系和作用機制；④抗菌肽作為藥物制劑時的藥代動力學相關問題；⑤雜合抗菌肽大規(guī)模高表達的生產(chǎn)方法。隨著對抗菌肽更深入的研究和基因工程的進展及生化技術的提高，不久的將來抗菌肽的臨床應用可以部分減少甚至取代抗生素的使用，給人類帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

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