沙門(mén)氏菌是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)及動(dòng)物生命健康的人畜共患病原菌，被沙門(mén)氏菌污染的飼料往往是人和動(dòng)物被感染的源頭。沙門(mén)氏菌屬種較多，分布廣泛，目前已知有2449種血清型，可引起人和動(dòng)物急性胃腸炎、傷寒、敗血癥以及腸外灶性感染等，已被FAO列為A類(lèi)病原微生物。目前國(guó)內(nèi)外均對(duì)飼料中沙門(mén)氏菌的污染采取了嚴(yán)格的檢測(cè)及控制措施，我國(guó)GB13078-2001中規(guī)定，畜禽飼料中不得檢出沙門(mén)氏菌。隨著研究的不斷深入，微生物學(xué)及生化鑒定、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)鑒定陸續(xù)被應(yīng)用于飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)，取得了一定的成就。
1 飼料中沙門(mén)氏菌污染現(xiàn)狀
    動(dòng)物源性飼料是畜禽飼料中的主要污染源，其中以骨粉、魚(yú)粉、血粉等蛋白質(zhì)飼料最易被沙門(mén)氏菌污染。周春紅等(2004)對(duì)從江蘇省隨機(jī)抽取的包含魚(yú)粉、肉骨粉、配合飼料等的95份飼料樣品中檢測(cè)出5份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為5.26%。余萍和焦彥朝(2005)對(duì)來(lái)自貴州省2002年上半年全國(guó)飼料抽檢的19批樣品進(jìn)行檢測(cè)，沙門(mén)氏菌檢出率為26.3%。余蓮和磨龍春(2002)從廣西隨機(jī)抽取的33份動(dòng)物性飼料通過(guò)預(yù)增菌、增菌和分離培養(yǎng)共檢測(cè)出6份陽(yáng)性樣品，檢出率為18.1%。
    何繼軍和王彪(2009)通過(guò)常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)，從229份樣品中分離到沙門(mén)氏菌27株，分離率11.8%，其中配合飼料陽(yáng)性率為10.1%，濃縮飼料陽(yáng)性率為7.8%，魚(yú)粉陽(yáng)性率為18.2%，肉骨粉陽(yáng)性率為15.4%。同時(shí)，進(jìn)口飼料中檢測(cè)出沙門(mén)氏菌的報(bào)道屢有出現(xiàn)。陳沁等(2002)通過(guò)常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)，對(duì)498份上海口岸2001年1～6月份進(jìn)口的動(dòng)物源性飼料進(jìn)行了沙門(mén)氏菌的分離鑒定，結(jié)果沙門(mén)氏菌株分離率為4.62%，其中，魚(yú)粉陽(yáng)性率3.66%，肉骨粉陽(yáng)性率為13.95%，明蝦殼陽(yáng)性率18.52%。
2 飼料中沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法
2.1 微生物學(xué)及生化鑒定方法
2.1.1 國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法
    目前對(duì)飼料中沙門(mén)氏菌的檢查主要依賴于常規(guī)微生物學(xué)方法，即按照《飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法》(GB/T13091-2002)規(guī)定的步驟進(jìn)行檢測(cè)，采用增菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定等傳統(tǒng)的分析方法，一般耗時(shí)5～7d。該法鑒定程序繁瑣，生化結(jié)果判定主觀性較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
2.1.2 科瑪嘉顯色培養(yǎng)鑒定
    周春紅等(2004)將隨機(jī)抽檢的95份飼料樣本采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)鑒定，經(jīng)孵育培養(yǎng)后共有7份樣本在顯色培養(yǎng)基上呈典型的紫色菌落，經(jīng)氧化酶試驗(yàn)排除2份假陽(yáng)性，其余5份陽(yáng)性樣本經(jīng)用VITEKID32E進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)，證實(shí)均為沙門(mén)氏菌屬，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)法檢測(cè)結(jié)果完全一致。較之常規(guī)檢測(cè)方法，不僅可以縮短檢測(cè)時(shí)間和減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并易于判定陽(yáng)性結(jié)果。
2.1.3 AOAC 生物化學(xué)工具鑒定法
    余萍等(2005)參照法國(guó)生物梅里埃公司AOAC食品中沙門(mén)氏菌屬的生物化學(xué)工具鑒定法，采用商品化的API20E試劑條及試劑分別對(duì)從貴州省市場(chǎng)抽檢的飼料樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)，并將試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用APLAB鑒定軟件V4.0進(jìn)行分析，得出與國(guó)標(biāo)方法一致的檢測(cè)結(jié)果。檢驗(yàn)結(jié)果表明，該法較之國(guó)標(biāo)法具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，該法充分地把現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)同微生物檢測(cè)緊密結(jié)合起來(lái)，不僅可以縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高工作效益，減輕勞動(dòng)強(qiáng)度，而且提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，易標(biāo)準(zhǔn)化。
2.1.4 β-萘酚辛酸酯試紙法
    沙門(mén)氏菌屬能產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的辛酯酶而解離辛酸酯類(lèi)化合物，該特性也逐步被用于飼料中沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)中。饒正華等(2005)利用辛酰氯與β-萘酚反應(yīng)生成β-萘酚辛酸酯，將其作為底物制成檢測(cè)試紙對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，該試紙具有很好的特異性。利用β-萘酚辛酸酯試紙法檢測(cè)飼料中的沙門(mén)氏菌具有快速、簡(jiǎn)單、直觀、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。
    β-萘酚辛酸酯比4-甲基傘形酮辛酯(MUCAP)標(biāo)準(zhǔn)品的成本更低，實(shí)驗(yàn)室易于合成，而且β-萘酚辛酸酯顏色法無(wú)需使用任何熒光設(shè)備，只需目測(cè)顏色即可得知檢測(cè)結(jié)果。然而，β-萘酚辛酸酯試紙法也具有一定缺陷，由于β-萘酚辛酸酯本身不夠穩(wěn)定而易分解，致使試紙的有效期較短。
2.2 免疫學(xué)診斷方法
2.2.1 乳膠凝集試驗(yàn)法
    莊成玉等(2006)用沙門(mén)氏菌多價(jià)血清致敏乳膠并制成乳膠抗體，建立了沙門(mén)氏菌乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法。用所建立的乳膠凝集試驗(yàn)方法和常規(guī)分離培養(yǎng)檢測(cè)法檢測(cè)75份成品飼料，結(jié)果乳膠凝集試驗(yàn)成品飼料陽(yáng)性16份，常規(guī)分離培養(yǎng)檢測(cè)法成品飼料陽(yáng)性18份，兩種方法的陽(yáng)性符合率為83.3%，結(jié)果表明，乳膠凝集試驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、特異性強(qiáng)且可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是一種適合基層單位用來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的可靠方法。
2.2.2 單抗ELISA 法
    自酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)被運(yùn)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)以來(lái)，學(xué)者們不斷對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，力求更敏感、更便捷。顧炳泉等(1996)運(yùn)用單抗ELISA法檢測(cè)2000份進(jìn)口魚(yú)粉樣品，陽(yáng)性檢出率為2.5%，同時(shí)用國(guó)標(biāo)法作為對(duì)照，其檢出率為2%，表明單抗ELISA法較之國(guó)標(biāo)法靈敏度高。
2.2.3 Dot-ELISA 法
    斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Dot-ELISA)法是由Hawkes等(1982)根據(jù)某些固相載體具有較強(qiáng)吸附蛋白質(zhì)能力的特點(diǎn)而建立的一種新的免疫學(xué)診斷方法，目前以其特異敏感、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)勢(shì)在沙門(mén)氏菌檢測(cè)中得以廣泛應(yīng)用。雷風(fēng)等(2005)選用硝酸纖維素膜作固相載體建立了檢測(cè)沙門(mén)氏菌的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷方法，并利用此方法檢測(cè)100份成品飼料，沙門(mén)氏菌的最低檢出量為400個(gè)/mL，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性檢出率為43%，常規(guī)分離培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率為38%，兩者符合率為83.72%。
3 分子生物學(xué)診斷方法
3.1 常規(guī)PCR 法
    近年來(lái)， 隨著分子檢測(cè)水平的不斷深入，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)以其優(yōu)良的敏感性、特異性以及簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，逐步被運(yùn)用于沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。Rohn等(1992)首先根據(jù)設(shè)計(jì)沙門(mén)氏菌保守序列invA基因核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，其引物為F：5’-GTGAAATTATCGCCACGTT-3’，R：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為284bp，被用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌，檢出率為97%。魏麟和黎曉英(2005)運(yùn)用上述方法中設(shè)計(jì)的引物，成功運(yùn)用于飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。張秀芹等(2008)也根據(jù)invA基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其引物為F：5’-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3’，R：5’-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3’其擴(kuò)增產(chǎn)物為331bp大小的特異條帶，該方法特異性達(dá)100%，敏感性達(dá)104cfu/mL。
3.2 復(fù)合PCR-DHPLC 法
    曹際娟等(2008)應(yīng)用復(fù)合PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，通過(guò)通用增菌培養(yǎng)，建立了動(dòng)物源性飼料中沙門(mén)氏菌和志賀氏菌的快速高通量檢測(cè)方法。根據(jù)沙門(mén)氏菌和志賀氏菌特異基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，復(fù)合PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。以49株參考菌株做特異性試驗(yàn)，并開(kāi)展了精密度檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有很好的特異性和精密度，經(jīng)通用增菌和復(fù)合PCR-DHPLC技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)飼料中的沙門(mén)氏菌和志賀氏菌。該方法可以快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)，是動(dòng)物源性飼料中致病菌高通量檢測(cè)的新技術(shù)。
3.3 恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)
    劉洵(2007)以沙門(mén)氏菌invA基因?yàn)槟康钠�段設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)條件優(yōu)化，成功建立了沙門(mén)氏菌環(huán)媒恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、解旋恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(HDA)法，并對(duì)來(lái)自長(zhǎng)沙的108份飼料用LAMP、HDA法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定法進(jìn)行對(duì)照。LAMP檢出沙門(mén)氏菌陽(yáng)性20份，陽(yáng)性率為18.5%，HDA檢出沙門(mén)氏菌陽(yáng)性29份，陽(yáng)性率為l7.6%，常規(guī)法檢出沙門(mén)氏菌陽(yáng)性21份，陽(yáng)性率19.44%。兩種方法與常規(guī)法的陽(yáng)性符合率分別是90.48%、95.24%。HDA產(chǎn)物克隆后送公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果陽(yáng)性菌株克隆的DNA序列與GenBallk中發(fā)表的入侵因子基因序列相同。表明建立的LAMP法、HDA法檢測(cè)沙門(mén)氏菌具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏等特點(diǎn)，適合基層實(shí)驗(yàn)室使用。
4 結(jié)語(yǔ)與展望
    長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外沙門(mén)氏菌的檢測(cè)研究主要集中于動(dòng)物致病后及食品中污染，相較而言飼料中的沙門(mén)氏菌的檢測(cè)技術(shù)略遜于前者。目前，國(guó)內(nèi)飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)主要依賴于國(guó)標(biāo)方法，但其浪費(fèi)人力物力而且耗時(shí)較長(zhǎng)，以致不同程度地影響著其使用價(jià)值。近年來(lái)，應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和分子遺傳學(xué)技術(shù)與計(jì)算機(jī)相結(jié)合或以此為基礎(chǔ)拓展的新方法，對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行快速檢驗(yàn)研究取得了較大的成就，然而其在飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)有待進(jìn)一步深入。伴隨著分析化學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，諸多儀器分析手段和方法如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)等，以及近年來(lái)熱點(diǎn)研究的病原菌基因芯片檢測(cè)技術(shù)，均已充分展現(xiàn)出在病原菌檢測(cè)中的潛力，為檢測(cè)和鑒定飼料中沙門(mén)氏菌帶來(lái)了新的契機(jī)。