仿生消化法評定豬飼料生物學(xué)效價(jià)的優(yōu)點(diǎn)與研究進(jìn)展
2014-1-10 飼料人才網(wǎng)
飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評定的宗旨是為了揭示飼料被畜禽采食后消化、吸收，經(jīng)過動物循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入相應(yīng)的組織器官，再轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品的過程。在表達(dá)消化、代謝、轉(zhuǎn)化的過程及其涵義方面，前人曾提出種種倡議。Fox將“生物學(xué)效價(jià)”定義為“飼料中某種養(yǎng)分支持生物機(jī)體結(jié)構(gòu)與機(jī)能正常的量化估測”；Sibbald(1987)認(rèn)為“生物學(xué)效價(jià)”是一種抽象的概念，是養(yǎng)分進(jìn)入體組織后用于正常代謝機(jī)能的效益；Ammerman將“生物學(xué)效價(jià)”定義為：動物食入營養(yǎng)素中能被小腸吸收并參與代謝過程或貯存在動物組織中的部分占食入總量的比值；許振英將生物學(xué)效價(jià)剖分為“絕對生物學(xué)效價(jià)”與“相對生物學(xué)效價(jià)”兩類概念；張子儀認(rèn)為“飼料生物學(xué)效價(jià)”應(yīng)包括消化率(digestibility)、吸收率(absorbability)、代謝率(metabolizability)、同化(assimilation)、有效性(utilization)、可利用率(availability)乃至飼料組合效應(yīng)(associ ative effect of feeds)等多重涵義。
在生物學(xué)效價(jià)的評定手段上，動物營養(yǎng)學(xué)家們在消化能、代謝能和凈能的測試手段、立論依據(jù)、數(shù)學(xué)模型等方面進(jìn)行過大量的研究。最早可溯及法國化學(xué)家拉瓦錫(Lavaisier Antoine Laurent，1743～1794)創(chuàng)建的小型動物呼吸代謝熱量測定裝置，他首次否定了“燃素說”，命名氧元素為“oxygen”，闡明了燃燒作用的氧化學(xué)說，再一次證實(shí)了“質(zhì)量守恒定律”。經(jīng)過近兩個多世紀(jì)的科研實(shí)踐，迄今消化能和代謝能測值仍然是“凈能體系”賴以成立的關(guān)鍵性決策依據(jù)。但是經(jīng)過實(shí)踐，許多學(xué)者從不同角度對飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中的有效能值采用凈能體系提出質(zhì)疑，如Wiseman和Cole認(rèn)為凈能值太敏感不適宜實(shí)際應(yīng)用；美國NRC的專家們認(rèn)為凈能的測定太困難、不精確和受影響的因素太多；Emmans總結(jié)指出：能量用于維持和脂肪沉積、蛋白沉積的效率是不一樣的，因此不能用“凈能”來簡單描述；Whittemore認(rèn)為凈能指標(biāo)并不比消化能、代謝能指標(biāo)為優(yōu)化飼料配方或預(yù)測生產(chǎn)成績提供更為精確的信息。因此，當(dāng)前對飼料能量生物學(xué)效價(jià)評定的一個共識仍然是像Fuller指出的那樣：“一個體系越是追求生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，則其測值更易受動物的影響，變異就更大，因此也相應(yīng)更不精確”。
縱觀國內(nèi)外對于飼料能量生物學(xué)效價(jià)的種種評定方法，可以認(rèn)為在生物學(xué)效價(jià)的概念上，評定方法、手段的邏輯性上，理論與實(shí)踐的結(jié)合上都存在許多懸而未決的問題，應(yīng)該承認(rèn)當(dāng)前被長期沿用的種種傳統(tǒng)生物學(xué)效價(jià)評定方法大多是屬于約定俗成的權(quán)宜之計(jì)�；谝陨险J(rèn)識，本文對in vitro消化法方面的研究歷史進(jìn)行了簡要回顧，大體上可分為“單一胃酶in vitro消化”階段、“胃-腸酶多步法in vitro消化”階段及作者等正在探索中的“電腦仿生程控三步消化法”三個歷史進(jìn)程。為了尋求便捷、實(shí)用、可信的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評定方法的科學(xué)技術(shù)路線，作者等曾對Furuya用“胃蛋白酶-豬小腸液”(PIF)的in vitro法測定消化能的方法及存在的問題進(jìn)行了驗(yàn)證，初步認(rèn)識到“以還原論為指導(dǎo)思想，將任何局部運(yùn)動之和等同為整體的理念將很難解決傳統(tǒng)方法中存在的種種弊端”�；谝陨险J(rèn)識，作者等從單胃動物豬、禽的仿生酶譜的建立，酶水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化乃至電腦程控消化系統(tǒng)中必須高度關(guān)注的關(guān)鍵性技術(shù)的全程仿生優(yōu)化組合技術(shù)路線及實(shí)施方案進(jìn)行了整體規(guī)劃。復(fù)雜問題的簡單化必須從零開始，需要通過大量實(shí)踐檢驗(yàn)才有可能達(dá)到日趨客觀的現(xiàn)實(shí)。基于以上認(rèn)識，本文首先回顧了用in vitro酶水解法評定豬飼料消化能(DE)及氨基酸利用率(AAA)的簡史，作者等基于用仿生消化電腦程控系統(tǒng)評定豬飼料EHGE的現(xiàn)狀及進(jìn)程，最后對用仿生酶消化電腦程控系統(tǒng)評定飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。希望能集思廣益，得到同行們的支持與批評指正。
1 國內(nèi)外用in vitro 消化法評定豬飼料消化能的研究進(jìn)展概況
由于動物代謝試驗(yàn)法耗資、費(fèi)力、效率低，重演性、可比性差，同時測值又受到種種測試條件的限制，因此，自20世紀(jì)50年代以來，許多學(xué)者在通過in vitro法或insitu法，在探索模擬飼料養(yǎng)分在畜禽體內(nèi)的消化代謝規(guī)律的基礎(chǔ)上提出了種種簡捷、易于執(zhí)行的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的評定方法，并在研究動物消化酶的變異規(guī)律及其對不同養(yǎng)分的水解環(huán)境，從不同的角度進(jìn)行過大量工作。但從文獻(xiàn)報(bào)道的頻率和實(shí)際應(yīng)用方面則顯得不夠系統(tǒng)�？傮w來說是時起時落，尤其在in vitro消化法的研究方面，更顯得分散。粗略概括，大致是從早期的簡單模擬胃酶消化過程到中期的模擬胃、腸道多步消化，最后向近期的全消化道仿生酶譜的建立到電腦仿生程控的方向發(fā)展。
1.1 簡單胃酶消化法
最早Sheffner等用胃蛋白酶對飼料進(jìn)行了in vitro消化試驗(yàn)，并用以評定飼料或食物中蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值。該法見于AOAC等早期版本，作為測定動物性蛋白質(zhì)飼料消化率的經(jīng)典方法沿用至今。我國也于1999年根據(jù)等同采用原則將該法列入飼料行業(yè)中的國家級推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17811-1999，GB/T17811-2008)。此外，有關(guān)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和凝乳酶等方面的報(bào)道不勝枚舉。胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，其他酶的含量較低，一般忽略不計(jì)。用胃蛋白酶水解法評定飼料或食物的可消化性，雖然只能反映在規(guī)范水解條件下對某一飼料或食物中的蛋白質(zhì)生物學(xué)效價(jià)的一個片面評價(jià)。由于這種方法便捷、重復(fù)性好、可比，而且醫(yī)藥用胃蛋白酶產(chǎn)品早已標(biāo)準(zhǔn)化，因此，仍然作為一種相對參比值被相關(guān)行業(yè)廣泛接受。
1.2 胃一腸酶多步水解法
鑒于用單一胃酶法評定飼料生物學(xué)效價(jià)的局限性。從20世紀(jì)70年代以后，許多學(xué)者在單一胃酶處理的基礎(chǔ)上用胰液、豬小腸液(porcine intestinal fluids，PIF)以及商品復(fù)合酶(如Viscozyme)乃至20%磺基水楊酸(PSA)等用于飼料有效能或蛋白質(zhì)氨基酸的“生物學(xué)效價(jià)”評定。
Goering和VanSoest最早用胃蛋白酶-豬小腸液(PIF)的in vitro消化方法，估測了飼料淀粉、粗蛋白的消化率和日糧纖維的降解率。這主要是基于日糧干物質(zhì)和粗蛋白的in vitro消化率測值與體內(nèi)消化率測值之間存在著較好的相關(guān)性。
Furuya等在系統(tǒng)研究了豬胃蛋白酶及PIF的最佳水解環(huán)境條件之后，提出了用胃蛋白酶及PIF凍干粉水溶液模擬胃腸兩步消化的in vitro法。Lowgren等在該法的基礎(chǔ)上，采用十二指腸液處理12h，再用回腸液和糞提取液處理48h，粗略評價(jià)了豬飼料樣品的in vitro干物質(zhì)消化率。
張子儀等(1982～1984)在前人工作的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)比較了從不同品種豬、飼喂不同類型日糧、不同瘺術(shù)部位采集的PIF酶活效價(jià)、鮮PIF與PIF凍干粉水溶液的酶活效價(jià)的差異，并在PIF凍干粉的保質(zhì)期、用PIF法測值的精度、重演性、可加性以及PIF法測值與全收糞法測值間的相關(guān)關(guān)系開展了必要的性能檢驗(yàn)。通過兩者之間的相關(guān)關(guān)系建立了以in vitro法為變量，以全收糞法為因變量，提出了豬飼料消化能值的回歸公式。經(jīng)過“七五”國家攻關(guān)全國協(xié)作及科研教學(xué)單位驗(yàn)證后，總結(jié)出了以胃蛋白酶和豬小腸液凍干粉水溶液處理為主要手段的in vitro消化試驗(yàn)方案。該法已被中國飼料工業(yè)協(xié)會、中國農(nóng)科院飼料所主編的《飼料生物學(xué)效價(jià)評定技術(shù)規(guī)程》所采納。由于該方案是手工操作，因此，受豬小腸液的采集、凍干粉的制備、貯存條件、水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化以及試劑盒的貯存條件、保質(zhì)期、售后服務(wù)以及測試者的素質(zhì)培訓(xùn)等客觀社會條件的限制，迄今該方法仍然難在生產(chǎn)上被廣大用戶接受。
此后，盧福莊等、杜榮等、李文英等還曾用PIF法與全收糞法的雞日糧代謝能值進(jìn)行了對比。在此前后，Drake曾用胃蛋白酶、胰酶連續(xù)透析法研究了畜禽對淀粉的消化率。Savoie和Gauthier、Derosicrs等曾用分子量為1000Da的透析袋在自制消化裝置中模擬了飼料蛋白質(zhì)的in vitro消化方法，研究了熱處理乳清蛋白中賴氨酸的破壞程度和食物中蛋白質(zhì)的in vitro消化率。
在這歷史時期，Dierick曾提出用胃蛋白酶制劑與胰酶制劑水解處理為標(biāo)志的in vitro兩步法。
在測定豬的能量消化率及蛋白質(zhì)、氨基酸利用率方面也取得了令人滿意的結(jié)果，但都限于所用酶制劑的標(biāo)準(zhǔn)化問題、以及試劑盒開發(fā)中的技術(shù)規(guī)范問題是否能達(dá)到腸道全程仿生效果，尚待進(jìn)一步研究。
進(jìn)入20世紀(jì)90年代，Bosien等、Boisen和Fernandez等、Bosien等前后報(bào)道了用胃蛋白酶-豬胰酶及Visozyme評定了飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)和能量in vitro消化率，并與體內(nèi)法對比測定后，獲得令人滿意的結(jié)果。
加拿大學(xué)者Regmi等以三角瓶為反應(yīng)器，用胃蛋白酶-胰酶-“Viscozyme”①“PSA”②處理為主線的模擬胃腸水解環(huán)境及水解產(chǎn)物分離為目標(biāo)的in vitro法，提出了預(yù)測生長豬對大麥樣本全消化道能量表觀消化率(apparent total tract digestibility，ATTD)的回歸模型(y=1.23x-25.33；R2=0.97)。
綜上所述，從仿生消化法研究的歷程分析，其初衷都是以便捷為前提，為獲取趨近于可信的生物學(xué)法信息為目標(biāo)，以精度、重演性好為約束條件。從上述單一胃消化法與胃腸酶消化多步法的設(shè)計(jì)原則分析，基本上如出一轍。從各家在選定的消化酶或商品消化酶產(chǎn)品的功能分析方面也都難免有以點(diǎn)代面，以面代全之嫌，在實(shí)際操作中又存在著酶譜設(shè)計(jì)、酶活力乃至酶與酶、外源酶與內(nèi)源酶之間互補(bǔ)頡頑，以及手工操作中不可回避的種種未知因素的干擾。因此，作者等認(rèn)為：沿用了近一個世紀(jì)的各種方案，都有必要互通有無，取長補(bǔ)短，在模擬全消化道酶水解體系的仿生學(xué)方面作進(jìn)一步努力。
1.3 仿生酶消化法
進(jìn)入21世紀(jì)前后，許多學(xué)者又沿著胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme法的技術(shù)路線，在重演性方面進(jìn)行了類似研究。在Boisen等研究基礎(chǔ)上，Noblet等又用胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme系統(tǒng)分析了115種復(fù)合飼料和68種飼料成分。肯定了該體系對生長豬的飼料中有機(jī)物以及代謝能和凈能的生物學(xué)效價(jià)評定方面具有可重復(fù)性。但是同時也指出該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過程相對復(fù)雜。Kim也指出在水解產(chǎn)物中油脂分離的重復(fù)性較差。
Boisen本人也指出該系統(tǒng)中在模擬消化液的制備、緩沖液的組成及水解時長等方面存在著操作者之間的隨意性等遺留問題。
總體回顧，在諸多的國內(nèi)外研究者公開報(bào)道的酶消化體系的in vitro測試手段方面，基本上停留在以三角瓶、透析管、搖床等為組件的手工操作階段，人為設(shè)定酶譜條件下獲得的信息。無論從仿生的角度及從所獲參數(shù)的可比性與可重復(fù)性等方面都具有很大的局限性。為此，本研究組從20世紀(jì)后期開始，就仿生酶譜的設(shè)計(jì)定型依據(jù)，消化過程中水解環(huán)境、消化液的加入、乃至水解產(chǎn)物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統(tǒng)、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制(離子濃度、緩沖體系、pH等)、反應(yīng)溫度、消化時長等因素的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范等方面的立論依據(jù)開展了研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了第一代到第三代“單胃動物仿生消化系統(tǒng)”。
2 仿生酶消化法的發(fā)展目標(biāo)
回顧早期工作，基本是屬于探索到追蹤的過程。進(jìn)入21世紀(jì)，雖然在影響單胃動物消化酶譜的因素及其發(fā)育變異規(guī)律方面進(jìn)行了必要研究，但仍屬初學(xué)階段，更復(fù)雜的問題乃至在傳統(tǒng)飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)評定方面的難題還有待努力探索與深入研究。
基于“仿生”這主題本身就是一個永恒的課題，因此，因此作者等認(rèn)為：攻堅(jiān)的程序也只能以“已知”求“未知”。一蹴而就、一次到位是困難的，也是不可能的。
基于以上認(rèn)為：(1)為了能更趨近于動態(tài)宿主主體在特定時間、空間條件下獲取飼料營養(yǎng)價(jià)值的客觀信息，首先應(yīng)該在傳統(tǒng)飼料營養(yǎng)評定工作的理論、涵義、評定手段等方面作整體反思，并能在被現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)與飼料工業(yè)所急需的便捷手段上尋求可行性技術(shù)路線。(2)在尚未能一次性獲得公允方案之前，所有創(chuàng)新方案應(yīng)具備以下條件：
①在規(guī)定試驗(yàn)研究條件下所獲得的信息或參數(shù)必須具有可信的精度和重演性，有利于對過去及未來的科研信息在同一條件下可比、可重演，以有利于用傳統(tǒng)法或種種倡議生成數(shù)據(jù)的吐故納新、淘而不汰；②飼料生物學(xué)效價(jià)評定項(xiàng)目名詞術(shù)語應(yīng)在相關(guān)信息管理系統(tǒng)的約束規(guī)定條件下標(biāo)準(zhǔn)化。繁簡的度也應(yīng)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，作出適度的選擇(如DE-ME-NE-NEm)；③對試驗(yàn)動物特別是“荷術(shù)動物”(hostal animal)應(yīng)在動物福利(animal welfare)理念下更新觀念，提出試驗(yàn)動物必須是在健康、舒適、無應(yīng)激的飼養(yǎng)環(huán)境下所獲得的信息；④不同種類、不同生長階段的畜禽飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)仿生評定系統(tǒng)也應(yīng)擇重、漸進(jìn)、組織全國分期分批有計(jì)劃地協(xié)作完成。
3 結(jié)語
對傳統(tǒng)的以“套算法”為立論依據(jù)的豬單個飼料營養(yǎng)價(jià)值評定體系，許多學(xué)者從組合效應(yīng)及邏輯學(xué)等角度提出質(zhì)疑。作者等認(rèn)為：鑒于豬是雜食動物，從仿生學(xué)角度分析，其難度應(yīng)是介于反芻動物與禽類之間的復(fù)雜問題。從國情考慮，還面對著以配合飼料為主的規(guī)�；B(yǎng)殖業(yè)體系與有啥喂啥的千家萬戶養(yǎng)殖業(yè)體系。因此，在建立仿生酶消化法體系時，應(yīng)從我國養(yǎng)豬業(yè)的整體考慮，應(yīng)注意“粗飼料類型日糧”與“精飼料類型日糧”兩大飼料飼養(yǎng)體系的背景，審時度勢，擇重優(yōu)化技術(shù)路線。
在生物學(xué)效價(jià)的評定手段上，動物營養(yǎng)學(xué)家們在消化能、代謝能和凈能的測試手段、立論依據(jù)、數(shù)學(xué)模型等方面進(jìn)行過大量的研究。最早可溯及法國化學(xué)家拉瓦錫(Lavaisier Antoine Laurent，1743～1794)創(chuàng)建的小型動物呼吸代謝熱量測定裝置，他首次否定了“燃素說”，命名氧元素為“oxygen”，闡明了燃燒作用的氧化學(xué)說，再一次證實(shí)了“質(zhì)量守恒定律”。經(jīng)過近兩個多世紀(jì)的科研實(shí)踐，迄今消化能和代謝能測值仍然是“凈能體系”賴以成立的關(guān)鍵性決策依據(jù)。但是經(jīng)過實(shí)踐，許多學(xué)者從不同角度對飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)中的有效能值采用凈能體系提出質(zhì)疑，如Wiseman和Cole認(rèn)為凈能值太敏感不適宜實(shí)際應(yīng)用；美國NRC的專家們認(rèn)為凈能的測定太困難、不精確和受影響的因素太多；Emmans總結(jié)指出：能量用于維持和脂肪沉積、蛋白沉積的效率是不一樣的，因此不能用“凈能”來簡單描述；Whittemore認(rèn)為凈能指標(biāo)并不比消化能、代謝能指標(biāo)為優(yōu)化飼料配方或預(yù)測生產(chǎn)成績提供更為精確的信息。因此，當(dāng)前對飼料能量生物學(xué)效價(jià)評定的一個共識仍然是像Fuller指出的那樣：“一個體系越是追求生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，則其測值更易受動物的影響，變異就更大，因此也相應(yīng)更不精確”。
縱觀國內(nèi)外對于飼料能量生物學(xué)效價(jià)的種種評定方法，可以認(rèn)為在生物學(xué)效價(jià)的概念上，評定方法、手段的邏輯性上，理論與實(shí)踐的結(jié)合上都存在許多懸而未決的問題，應(yīng)該承認(rèn)當(dāng)前被長期沿用的種種傳統(tǒng)生物學(xué)效價(jià)評定方法大多是屬于約定俗成的權(quán)宜之計(jì)�；谝陨险J(rèn)識，本文對in vitro消化法方面的研究歷史進(jìn)行了簡要回顧，大體上可分為“單一胃酶in vitro消化”階段、“胃-腸酶多步法in vitro消化”階段及作者等正在探索中的“電腦仿生程控三步消化法”三個歷史進(jìn)程。為了尋求便捷、實(shí)用、可信的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)評定方法的科學(xué)技術(shù)路線，作者等曾對Furuya用“胃蛋白酶-豬小腸液”(PIF)的in vitro法測定消化能的方法及存在的問題進(jìn)行了驗(yàn)證，初步認(rèn)識到“以還原論為指導(dǎo)思想，將任何局部運(yùn)動之和等同為整體的理念將很難解決傳統(tǒng)方法中存在的種種弊端”�；谝陨险J(rèn)識，作者等從單胃動物豬、禽的仿生酶譜的建立，酶水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化乃至電腦程控消化系統(tǒng)中必須高度關(guān)注的關(guān)鍵性技術(shù)的全程仿生優(yōu)化組合技術(shù)路線及實(shí)施方案進(jìn)行了整體規(guī)劃。復(fù)雜問題的簡單化必須從零開始，需要通過大量實(shí)踐檢驗(yàn)才有可能達(dá)到日趨客觀的現(xiàn)實(shí)。基于以上認(rèn)識，本文首先回顧了用in vitro酶水解法評定豬飼料消化能(DE)及氨基酸利用率(AAA)的簡史，作者等基于用仿生消化電腦程控系統(tǒng)評定豬飼料EHGE的現(xiàn)狀及進(jìn)程，最后對用仿生酶消化電腦程控系統(tǒng)評定飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的現(xiàn)實(shí)意義及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。希望能集思廣益，得到同行們的支持與批評指正。
1 國內(nèi)外用in vitro 消化法評定豬飼料消化能的研究進(jìn)展概況
由于動物代謝試驗(yàn)法耗資、費(fèi)力、效率低，重演性、可比性差，同時測值又受到種種測試條件的限制，因此，自20世紀(jì)50年代以來，許多學(xué)者在通過in vitro法或insitu法，在探索模擬飼料養(yǎng)分在畜禽體內(nèi)的消化代謝規(guī)律的基礎(chǔ)上提出了種種簡捷、易于執(zhí)行的飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)的評定方法，并在研究動物消化酶的變異規(guī)律及其對不同養(yǎng)分的水解環(huán)境，從不同的角度進(jìn)行過大量工作。但從文獻(xiàn)報(bào)道的頻率和實(shí)際應(yīng)用方面則顯得不夠系統(tǒng)�？傮w來說是時起時落，尤其在in vitro消化法的研究方面，更顯得分散。粗略概括，大致是從早期的簡單模擬胃酶消化過程到中期的模擬胃、腸道多步消化，最后向近期的全消化道仿生酶譜的建立到電腦仿生程控的方向發(fā)展。
1.1 簡單胃酶消化法
最早Sheffner等用胃蛋白酶對飼料進(jìn)行了in vitro消化試驗(yàn)，并用以評定飼料或食物中蛋白質(zhì)的生物學(xué)價(jià)值。該法見于AOAC等早期版本，作為測定動物性蛋白質(zhì)飼料消化率的經(jīng)典方法沿用至今。我國也于1999年根據(jù)等同采用原則將該法列入飼料行業(yè)中的國家級推薦標(biāo)準(zhǔn)(GB/T17811-1999，GB/T17811-2008)。此外，有關(guān)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶和凝乳酶等方面的報(bào)道不勝枚舉。胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，其他酶的含量較低，一般忽略不計(jì)。用胃蛋白酶水解法評定飼料或食物的可消化性，雖然只能反映在規(guī)范水解條件下對某一飼料或食物中的蛋白質(zhì)生物學(xué)效價(jià)的一個片面評價(jià)。由于這種方法便捷、重復(fù)性好、可比，而且醫(yī)藥用胃蛋白酶產(chǎn)品早已標(biāo)準(zhǔn)化，因此，仍然作為一種相對參比值被相關(guān)行業(yè)廣泛接受。
1.2 胃一腸酶多步水解法
鑒于用單一胃酶法評定飼料生物學(xué)效價(jià)的局限性。從20世紀(jì)70年代以后，許多學(xué)者在單一胃酶處理的基礎(chǔ)上用胰液、豬小腸液(porcine intestinal fluids，PIF)以及商品復(fù)合酶(如Viscozyme)乃至20%磺基水楊酸(PSA)等用于飼料有效能或蛋白質(zhì)氨基酸的“生物學(xué)效價(jià)”評定。
Goering和VanSoest最早用胃蛋白酶-豬小腸液(PIF)的in vitro消化方法，估測了飼料淀粉、粗蛋白的消化率和日糧纖維的降解率。這主要是基于日糧干物質(zhì)和粗蛋白的in vitro消化率測值與體內(nèi)消化率測值之間存在著較好的相關(guān)性。
Furuya等在系統(tǒng)研究了豬胃蛋白酶及PIF的最佳水解環(huán)境條件之后，提出了用胃蛋白酶及PIF凍干粉水溶液模擬胃腸兩步消化的in vitro法。Lowgren等在該法的基礎(chǔ)上，采用十二指腸液處理12h，再用回腸液和糞提取液處理48h，粗略評價(jià)了豬飼料樣品的in vitro干物質(zhì)消化率。
張子儀等(1982～1984)在前人工作的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)比較了從不同品種豬、飼喂不同類型日糧、不同瘺術(shù)部位采集的PIF酶活效價(jià)、鮮PIF與PIF凍干粉水溶液的酶活效價(jià)的差異，并在PIF凍干粉的保質(zhì)期、用PIF法測值的精度、重演性、可加性以及PIF法測值與全收糞法測值間的相關(guān)關(guān)系開展了必要的性能檢驗(yàn)。通過兩者之間的相關(guān)關(guān)系建立了以in vitro法為變量，以全收糞法為因變量，提出了豬飼料消化能值的回歸公式。經(jīng)過“七五”國家攻關(guān)全國協(xié)作及科研教學(xué)單位驗(yàn)證后，總結(jié)出了以胃蛋白酶和豬小腸液凍干粉水溶液處理為主要手段的in vitro消化試驗(yàn)方案。該法已被中國飼料工業(yè)協(xié)會、中國農(nóng)科院飼料所主編的《飼料生物學(xué)效價(jià)評定技術(shù)規(guī)程》所采納。由于該方案是手工操作，因此，受豬小腸液的采集、凍干粉的制備、貯存條件、水解環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化以及試劑盒的貯存條件、保質(zhì)期、售后服務(wù)以及測試者的素質(zhì)培訓(xùn)等客觀社會條件的限制，迄今該方法仍然難在生產(chǎn)上被廣大用戶接受。
此后，盧福莊等、杜榮等、李文英等還曾用PIF法與全收糞法的雞日糧代謝能值進(jìn)行了對比。在此前后，Drake曾用胃蛋白酶、胰酶連續(xù)透析法研究了畜禽對淀粉的消化率。Savoie和Gauthier、Derosicrs等曾用分子量為1000Da的透析袋在自制消化裝置中模擬了飼料蛋白質(zhì)的in vitro消化方法，研究了熱處理乳清蛋白中賴氨酸的破壞程度和食物中蛋白質(zhì)的in vitro消化率。
在這歷史時期，Dierick曾提出用胃蛋白酶制劑與胰酶制劑水解處理為標(biāo)志的in vitro兩步法。
在測定豬的能量消化率及蛋白質(zhì)、氨基酸利用率方面也取得了令人滿意的結(jié)果，但都限于所用酶制劑的標(biāo)準(zhǔn)化問題、以及試劑盒開發(fā)中的技術(shù)規(guī)范問題是否能達(dá)到腸道全程仿生效果，尚待進(jìn)一步研究。
進(jìn)入20世紀(jì)90年代，Bosien等、Boisen和Fernandez等、Bosien等前后報(bào)道了用胃蛋白酶-豬胰酶及Visozyme評定了飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)和能量in vitro消化率，并與體內(nèi)法對比測定后，獲得令人滿意的結(jié)果。
加拿大學(xué)者Regmi等以三角瓶為反應(yīng)器，用胃蛋白酶-胰酶-“Viscozyme”①“PSA”②處理為主線的模擬胃腸水解環(huán)境及水解產(chǎn)物分離為目標(biāo)的in vitro法，提出了預(yù)測生長豬對大麥樣本全消化道能量表觀消化率(apparent total tract digestibility，ATTD)的回歸模型(y=1.23x-25.33；R2=0.97)。
綜上所述，從仿生消化法研究的歷程分析，其初衷都是以便捷為前提，為獲取趨近于可信的生物學(xué)法信息為目標(biāo)，以精度、重演性好為約束條件。從上述單一胃消化法與胃腸酶消化多步法的設(shè)計(jì)原則分析，基本上如出一轍。從各家在選定的消化酶或商品消化酶產(chǎn)品的功能分析方面也都難免有以點(diǎn)代面，以面代全之嫌，在實(shí)際操作中又存在著酶譜設(shè)計(jì)、酶活力乃至酶與酶、外源酶與內(nèi)源酶之間互補(bǔ)頡頑，以及手工操作中不可回避的種種未知因素的干擾。因此，作者等認(rèn)為：沿用了近一個世紀(jì)的各種方案，都有必要互通有無，取長補(bǔ)短，在模擬全消化道酶水解體系的仿生學(xué)方面作進(jìn)一步努力。
1.3 仿生酶消化法
進(jìn)入21世紀(jì)前后，許多學(xué)者又沿著胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme法的技術(shù)路線，在重演性方面進(jìn)行了類似研究。在Boisen等研究基礎(chǔ)上，Noblet等又用胃蛋白酶-胰酶-Viscozyme系統(tǒng)分析了115種復(fù)合飼料和68種飼料成分。肯定了該體系對生長豬的飼料中有機(jī)物以及代謝能和凈能的生物學(xué)效價(jià)評定方面具有可重復(fù)性。但是同時也指出該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過程相對復(fù)雜。Kim也指出在水解產(chǎn)物中油脂分離的重復(fù)性較差。
Boisen本人也指出該系統(tǒng)中在模擬消化液的制備、緩沖液的組成及水解時長等方面存在著操作者之間的隨意性等遺留問題。
總體回顧，在諸多的國內(nèi)外研究者公開報(bào)道的酶消化體系的in vitro測試手段方面，基本上停留在以三角瓶、透析管、搖床等為組件的手工操作階段，人為設(shè)定酶譜條件下獲得的信息。無論從仿生的角度及從所獲參數(shù)的可比性與可重復(fù)性等方面都具有很大的局限性。為此，本研究組從20世紀(jì)后期開始，就仿生酶譜的設(shè)計(jì)定型依據(jù)，消化過程中水解環(huán)境、消化液的加入、乃至水解產(chǎn)物的分離，飼料樣品的制備、仿生酶消化系統(tǒng)、透析膜的篩選、飼料樣本量與消化酶的配套用量、緩沖液的配制(離子濃度、緩沖體系、pH等)、反應(yīng)溫度、消化時長等因素的標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范等方面的立論依據(jù)開展了研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了第一代到第三代“單胃動物仿生消化系統(tǒng)”。
2 仿生酶消化法的發(fā)展目標(biāo)
回顧早期工作，基本是屬于探索到追蹤的過程。進(jìn)入21世紀(jì)，雖然在影響單胃動物消化酶譜的因素及其發(fā)育變異規(guī)律方面進(jìn)行了必要研究，但仍屬初學(xué)階段，更復(fù)雜的問題乃至在傳統(tǒng)飼料養(yǎng)分的生物學(xué)效價(jià)評定方面的難題還有待努力探索與深入研究。
基于“仿生”這主題本身就是一個永恒的課題，因此，因此作者等認(rèn)為：攻堅(jiān)的程序也只能以“已知”求“未知”。一蹴而就、一次到位是困難的，也是不可能的。
基于以上認(rèn)為：(1)為了能更趨近于動態(tài)宿主主體在特定時間、空間條件下獲取飼料營養(yǎng)價(jià)值的客觀信息，首先應(yīng)該在傳統(tǒng)飼料營養(yǎng)評定工作的理論、涵義、評定手段等方面作整體反思，并能在被現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)與飼料工業(yè)所急需的便捷手段上尋求可行性技術(shù)路線。(2)在尚未能一次性獲得公允方案之前，所有創(chuàng)新方案應(yīng)具備以下條件：
①在規(guī)定試驗(yàn)研究條件下所獲得的信息或參數(shù)必須具有可信的精度和重演性，有利于對過去及未來的科研信息在同一條件下可比、可重演，以有利于用傳統(tǒng)法或種種倡議生成數(shù)據(jù)的吐故納新、淘而不汰；②飼料生物學(xué)效價(jià)評定項(xiàng)目名詞術(shù)語應(yīng)在相關(guān)信息管理系統(tǒng)的約束規(guī)定條件下標(biāo)準(zhǔn)化。繁簡的度也應(yīng)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，作出適度的選擇(如DE-ME-NE-NEm)；③對試驗(yàn)動物特別是“荷術(shù)動物”(hostal animal)應(yīng)在動物福利(animal welfare)理念下更新觀念，提出試驗(yàn)動物必須是在健康、舒適、無應(yīng)激的飼養(yǎng)環(huán)境下所獲得的信息；④不同種類、不同生長階段的畜禽飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價(jià)仿生評定系統(tǒng)也應(yīng)擇重、漸進(jìn)、組織全國分期分批有計(jì)劃地協(xié)作完成。
3 結(jié)語
對傳統(tǒng)的以“套算法”為立論依據(jù)的豬單個飼料營養(yǎng)價(jià)值評定體系，許多學(xué)者從組合效應(yīng)及邏輯學(xué)等角度提出質(zhì)疑。作者等認(rèn)為：鑒于豬是雜食動物，從仿生學(xué)角度分析，其難度應(yīng)是介于反芻動物與禽類之間的復(fù)雜問題。從國情考慮，還面對著以配合飼料為主的規(guī)�；B(yǎng)殖業(yè)體系與有啥喂啥的千家萬戶養(yǎng)殖業(yè)體系。因此，在建立仿生酶消化法體系時，應(yīng)從我國養(yǎng)豬業(yè)的整體考慮，應(yīng)注意“粗飼料類型日糧”與“精飼料類型日糧”兩大飼料飼養(yǎng)體系的背景，審時度勢，擇重優(yōu)化技術(shù)路線。
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